球盟会(中国)

研究示意图

（1）Ir1的合成、表征及与铜的结合性能

顺利获得多峰光谱分析系统地研究了Ir1与 Cu(II)/ Cu (I)的结合特性(图 1A )。在用 CuCl₂滴定过程中， Ir1的紫外/可见吸收光谱呈现出渐进性变化。在加入 1.0 eq的 Cu(II) 后，在 380 nm 处出现明显拐点，证实了 1:1 的结合化学计量。Cu(II)滴定出现340 nm等吸光点，图1B），。¹H NMR中δ 12.709 ppm信号减弱（Δδ ≈ 0.015 ppm，图1C）；对 Cu(II) 的不同光物理响应以浓度依赖性荧光猝灭为特征，而 Cu(I) 和 Zn(II) 的影响可忽略不计（图 1D）。X 射线光电子能谱 (XPS) 分析给予了 Cu 氧化还原循环的直接证据：Cu 2p 3/2结合能从 934.8 eV（Cu(II)）转移到 932.5 eV（Cu(I)），同时伴随震动卫星峰消失（图 1E-G）。顺利获得 X 射线吸收光谱 (XAS) 进一步阐明了 Ir1-Cu(II)和Ir1-Cu(I)配合物的配位结构。图1H显示了傅里叶变换的k3加权Cu K边扩展 X 射线吸收精细结构 (EXAFS)，两个配合物均出现了一个归因于 Cu–O/N 键的显著 1.50 Å 峰。值得注意的是，归一化的 XANES 光谱（图 1I ）显示Ir1-Cu(II)比Ir1-Cu(I)具有更高的吸收边能量，证实了Ir1-Cu(II)中铜价态的升高。Cu K边光谱的小波变换 (WT) 分析（图 1J-L）进一步验证了不同的配位环境。

图1 Ir1与铜离子的配位特性及GSH介导的还原。(A) Ir1的PDT模式切换示意图。(B, C) UV-Vis和¹H NMR滴定光谱。(E-G) XPS谱图。(H, I) XANES和EXAFS谱图

（2）Cu(II)配位和GSH还原诱导Ir1的II型向I型转化

如图2 A所示，在 Cu(II) 配位后，¹ O ₂生成显着降低，猝灭比分别为 5.6 ( Ir1-Cu(II) ) 和 2.7 ( Ir1-Cu(I) )，而Ir1-Zn(II)保持了相当的效率。而在顺利获得二氢罗丹明123 (DHR123) 监测的相同辐照条件下，Ir1-Cu(I)的超氧阴离子 (O₂^•-) 产量比游离Ir1增加了 1.3倍，表明 I型光动力活性增强，而Ir1-Cu(II) 的光动力活性则被抑制了 1.7倍（图 2B）。以羟基苯基荧光素（HPF）为探针，Ir1-Cu(I)在可见光下高效生成•OH，而Ir1-Cu(II)完全抑制该过程；GSH将Ir1-Cu(II)还原为Ir1-Cu(I)后活性恢复，•OH产率较原始Ir1提升1.3倍（图2C）。值得注意的是，525 nm 的光照射显著加速了这一过程，Ir1-Cu(II)在光照后 3 分钟内就实现了 GSH 的快速消耗（图 2D），这证明了Ir1-Cu(II)具有高效的光激活 GPx 样酶活性。为了量化肿瘤相关 pH 条件下 •OH 的产生，使用 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺 (TMB) 作为 H2O2活化的比色探针。如图 2E所示，Ir1-Cu(II)表现出 pH 依赖性催化行为：在生理 pH 7.4 (PBS) 下，在光照下观察到极少量的 •OH 生成。值得注意的是，与中性 pH 相比，酸性条件（pH 6.6）使 •OH 产生增加了 7.2 倍。利用紫外可见光谱研究了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 的氧化动力学。在 525 nm 的光照下，Ir1-Cu(II)诱导了特征光谱偏移：339 nm 处的特征峰降低（表明 NADH 消耗），260 nm 处的光谱升高（反映 NAD⁺ 的生成），证实Ir1-Cu(II)表现出 NADH 氧化酶样活性，顺利获得光控电子转移促进 NADH→NAD⁺ 的转化（图2F）。DFT计算显示Cu(I)配位使S₁→T₁能隙由3.03 eV降至2.79 eV，增强自旋轨道耦合与系间窜越（图2G）；电子顺磁共振与理论分析表明，Ir1-Cu(II)开壳层D₀态在光激发时面临高能量壁垒，GSH诱导电子回配对后回归闭壳层S₀，实现高效电荷分离（图2H）。基于上述结果，提出Ir1顺利获得 Cu 配位转换和 GSH 响应还原机制动态调节 I 型 ROS 生成（图2H、I）。

图2 Ir1在铜离子与GSH调控下的ROS生成模式切换。(A) ABDA探针显示Cu(II)配位抑制了¹O₂（Type II）的生成。(B, C) DHR123和HPF探针显示GSH还原后的Ir1-Cu(I)复合物高效生成O₂^•⁻和•OH（Type I）。(D-F) DTNB光谱图。(H, I) Type I ROS生成及协同代谢干扰机制示意图

（3）Ir1@FA@MOFs的构建与表征

利用Ir1的光敏特性，顺利获得Cu(II)-偶氮咪唑-Zn(II)配位开发了GSH消耗/缺氧适应性MOF平台（图3A）。Ir1@FA@MOFs的结构表征顺利获得透射电子显微镜 (TEM) 揭示了明确的纳米晶体形貌 (图3B)，元素映射证实了 Ir、Cu、Zn、C、N、O 和 S 物质的均匀分布 (图3C)。动态光散射 (DLS) 测量表明单分散纳米颗粒的流体动力学直径为 127.7 ± 0.6 nm (PDI = 0.113 ± 0.008)，水悬浮液中的 zeta 电位为 −20.2 ± 1.0 mV (图3D)。刺激响应分解研究揭示了 pH 依赖性降解（ pH 5.0 时Ir1释放 48.6% 而在pH 7.4 时仅释放6.3%）、ROS 引发的溶解加速（光照下Ir1释放 29.5% 而在黑暗条件下仅释放5.8%）和缺氧增强分解（有 Na₂S₂O₄（10 mM）时Ir1释放29.2% 相比没有 Na₂S₂O₄ 时仅释放5.1%），证实了 TME 响应性药物释放曲线（图3E-H）。

图3 Ir1@FA@MOFs纳米平台的构建与表征。(A) 纳米平台构建示意图。(B-D) TEM图像、元素映射和DLS粒径。(E-H) 在模拟TME条件（酸性、ROS、缺氧）下的药物释放曲线和TEM形貌变化

（4）Ir1@FA@MOFs介导的光动力治疗破坏MDA-MB-231细胞中的氧化还原平衡

基于先前的研究成果，证明了Cu(II)介导的从氧依赖性II型光动力途径向耐缺氧I型光动力途径的转变，采用了三种互补的ROS检测方法来量化Ir1@FA@MOFs的药效动力学作用。Ir1@FA@MOFs在光照下表现出剂量依赖性的ROS生成。在缺氧条件下也观察到显著的ROS生成，表明其具有双氧适应性（图4A-B）。使用•OH选择性HPF和O₂^•–靶向二氢乙锭 (DHE) 探针实现了ROS种类特异性的时空分辨率。共聚焦显微镜证实了•OH和O₂^•–的升高（图4C、E）。流式细胞术定量分析显示在常氧条件下•OH和O₂^•–分别增加了1.5倍和1.6倍，在缺氧条件下分别增加了1.4倍和2.0倍（图4D-F）。证明了Ir1@FA@MOFs的双途径机制：1）Cu(II)顺利获得配体-金属电荷转移和芬顿反应增强I/II型ROS的生成；2）硫醇耗竭介导的抗氧化防御抑制。这种组合策略有效地破坏了氧化还原稳态，同时减轻了缺氧诱导的光动力治疗（PDT）耐药性。

图4 Ir1@FA@MOFs在缺氧细胞中诱导Type I ROS的生成。(A-F) 共聚焦荧光成像和流式细胞术

（5）Ir1@FA@MOFs介导的光动力治疗（PDT）诱导铜死亡、铁死亡和PAN凋亡

TEM 分析表明，在缺氧条件下，Ir1@FA@MOFs介导的 PDT 在 MDA-MB-231 细胞中引起明显的线粒体肿胀和细胞质空泡化（图5A）。在缺氧条件下，5,5′，6,6′-四氯-1,1′，3,3′-四乙基苯并咪唑并羰花青碘化物 (JC-1) 染色和流式细胞术分析显示，在接受 PDT 治疗的细胞中，线粒体几乎完全去极化（94.7% 的细胞ΔΨ_m塌陷，而对照组为 0.3%），并伴有细胞肿胀（图5B-D）。为了阐明Ir1@FA@MOFs介导的光动力治疗（PDT）的潜在机制，采用了细胞死亡特异性阻断剂，包括铜死亡（四硫钼酸铵；ATTM）、铁死亡（Ferrostatin-1；Fer-1）、坏死性凋亡（Necrostatin-1；Nec-1）、焦亡（Necrosulfonamide；NSA）、凋亡（Z-VAD-FMK）和自噬（3-甲基腺嘌呤；3-MA）的抑制剂。在缺氧条件下，细胞活力挽救效率依次为：ATTM > Fer-1 > Nec-1 > NSA > Z-VAD-FMK，其中3-MA的作用可忽略不计。常氧条件下的反应也呈现出类似的趋势（图5E）。此外，缺氧条件下的蛋白质印迹分析量化了关键的生物标志物，包括铜死亡中铁氧还蛋白 1（FDX1）的减少和二氢硫辛酰胺 s-乙酰转移酶（DLAT；脂酰化指数）的降低（图5F），铁死亡标志物谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）表达降低（图5G）；坏死性凋亡关键蛋白 MLKL（Ser358）磷酸化水平升高（图5H）；焦亡执行蛋白 GSDMD-NT（31 kDa）剪切片段增加（图5I）；凋亡效应分子 Caspase-3（17/19 kDa）活化上调（图5J）。上述结果表明，Ir1@FA@MOFs介导的 PDT 顺利获得在常氧和缺氧条件下协同激活多种细胞死亡途径来诱导铜死亡、铁死亡和PAN死亡。

图5 Ir1@FA@MOFs-PDT协同诱导多模式程序性细胞死亡。(A) 透射电镜图像 (B, C) JC-1染色。(D) 共聚焦显微镜图。(E) 多种RCD抑制剂实验显示，铜死亡抑制剂(ATTM)和铁死亡抑制剂(Fer-1)等能显著挽救细胞活性。(F-J) Western Blot实验。（K）Ir1 @ FA @ MOFs在光照下导致多模态细胞死亡的作用机制示意图

（6）Ir1@FA@MOFs介导的光动力治疗（PDT）诱导ICD

共聚焦显微镜、流式细胞术和蛋白质印迹分析表明，Ir1@FA@MOFs介导的 PDT 在常氧和缺氧条件下均诱导剂量依赖性 DAMP 调节（图6A-E）。在缺氧条件下，Ir1@FA@MOFs介导的 PDT 引起 HMGB1 易位（与未处理的对照组相比，核 HMGB1 减少 0.37 倍）、CRT 暴露（表面 CRT 水平增加 1.2 倍）和 ATP 分泌（缺氧条件下细胞外 ATP 升高 2.5 倍）（图6A-F）。总之，Ir1@FA@MOFs介导的 PDT 顺利获得线粒体损伤驱动的铜死亡、铁死亡和PAN凋亡的融合，在常氧和缺氧环境下协调 ICD，缺氧增强的功效源于氧化还原循环放大的致死级联顺利获得多模式应激整合来启动抗肿瘤免疫。

图6 Ir1@FA@MOFs-PDT诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡(ICD)。(A-E) 免疫荧光、流式细胞术和Western Blot。(F) ATP检测试剂盒测量显示胞外ATP浓度显著升高

（7）Ir1@FA@MOFs介导的光动力治疗诱导的转录组改变

进行 RNA 测序以系统地评估缺氧条件下Ir1@FA@MOFs介导的 PDT 对转录组的影响。主成分分析（PCA）显示 PDT 治疗组和对照组之间存在明显的聚类关系，表明数据具有高度一致性和可重复性（图7A）。差异基因表达分析发现，在处理过的样本中，有 251 个基因显着上调，757 个基因下调（|log2FC|> 1，p<0.05；图7B）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析突出显示了 52 条免疫相关途径，代表最丰富的功能类别（图7C）。在排名前 10 位的上调途径中，关键的免疫调节过程被显著激活，包括中性粒细胞胞外陷阱形成、白细胞介素 17（IL-17）信号传导和肿瘤坏死因子（TNF）信号通路（图7D）。基因集富集分析 (GSEA) 证实，Ir1@FA@MOFs介导的光动力治疗 (PDT) 顺利获得协同上调凋亡、坏死性凋亡和焦亡途径诱导PAN凋亡 (PANoptosis)。这种多模式细胞死亡机制伴随着大量的 ROS 生成和 GSH 耗竭，表明细胞内氧化还原稳态严重紊乱。Ir1@FA@MOFs介导的 PDT 顺利获得激活 B 细胞的核因子 κ 轻链增强子 (NF-κB) 和 IL-17 通路激活 TNF-α 信号传导来增强促炎免疫反应。同时，观察到白细胞介素 2 信号转导和转录激活因子 5 (IL2-STAT5) 信号轴的下调，表明调节性 T 细胞 (Treg) 成熟和分化受到抑制，这可能会减轻 TME 内的免疫抑制 (图 7E )。上述结果表明，Ir1@FA@MOFs介导的 PDT 发挥多方面的作用，包括顺利获得线粒体损伤和氧化还原失衡诱导 PANoptosis、激活促炎免疫信号通路和重塑免疫抑制 TME。

图7 转录组学分析揭示Ir1@FA@MOFs-PDT对细胞信号通路的系统性调控。 (A) 主成分分析（PCA）显示，PDT治疗组与对照组在基因表达谱上呈现显著分离，表明治疗引起了全局性的、可重复的转录本变化。 (B) 火山图直观展示了PDT治疗后显著上调（251个）和下调（757个）的差异表达基因（DEGs）。 (C, D) KEGG通路分类与富集分析表明，差异基因主要富集于免疫相关通路，其中中性粒细胞胞外诱捕网形成、IL-17和TNF等关键促炎信号通路被显著激活。 (E) 基因集富集分析（GSEA）从通路层面证实，PDT治疗显著激活了与PAN凋亡（凋亡、坏死、焦亡）、活性氧生成及TNF-α/NF-κB等关键生物学过程相关的基因集

（8）Ir1@FA@MOFs介导的光动力治疗（PDT）抑制肿瘤生长并增强免疫激活

建立小鼠单侧移植瘤模型，系统评估Ir1@FA@MOFs介导的光动力治疗（PDT）的抗肿瘤疗效（图8A）。定量分析显示，Ir1@FA@MOFs-PDT组肿瘤抑制率约为50.86%，显著高于顺铂对照组约37.36%的抑制率（图8B、D ）。值得注意的是，在未接受光激活的Ir1@FA@MOFs的暗对照组中，未检测到统计学上显著的肿瘤抑制，证实了光依赖性治疗机制。所有实验组在整个治疗过程中体重均保持稳定，表明治疗相关的全身毒性极小（图8C）。多模态组织学分析（免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF））显示Ir1@FA@MOFs -PDT组和顺铂组均出现广泛的肿瘤损伤（图8E）。具体而言，Ir1@FA@MOFs -PDT诱导增殖抑制（增殖细胞核抗原（PCNA），图8F），铜死亡激活（FDX1，图8G），铁死亡激活（GPX4，图8I）和PANoptosis诱导（裂解的caspase-3，磷酸化的混合谱系激酶结构域样蛋白（p-MLKL）裂解的GSDMD图8H）。相反，顺铂治疗特异性上调了裂解的caspase-3，而其他细胞死亡模式标志物不受影响，进一步证实了顺铂的凋亡显性细胞死亡机制。IF分析显示，在用Ir1@FA@MOFs-PDT治疗的肿瘤中，钙网蛋白（CRT）膜易位增强，这是ICD的标志（图8J）。同时，这种治疗方式引发了强大的细胞毒性免疫激活，其特征是成熟树突状细胞（DC）从2.3％显着增加到5.66％（p<0.01；图8M ），肿瘤内CD8⁺T细胞浸润几乎增加了一倍（7.0％vs 13.2％，p<0.01；图8N）。这些免疫刺激作用顺利获得效应分子的上调表达得到进一步放大：免疫组织化学显示颗粒酶B（GZMB）（一种细胞毒性T淋巴细胞衍生的丝氨酸蛋白酶）的诱导，而干扰素-γ（IFN-γ）（一种协调抗肿瘤免疫的多效性细胞因子）显示出增加（图 8K-L）。结果表明，Ir1@FA@MOFs介导的光动力治疗不仅顺利获得多种死亡途径直接消灭肿瘤细胞，而且还重塑了免疫抑制性TME，表明其作为组合治疗策略的潜力。

图8 Ir1@FA@MOFs-PDT在体内抑制肿瘤生长并激活抗肿瘤免疫。(B-D) 肿瘤生长曲线、小鼠体重曲线及实体瘤照片。(E-L) 肿瘤组织切片的H&E、免疫组化和免疫荧光染色。(M, N) 流式细胞术