球盟会(中国)

图1 不同敷料多孔结构的表征。（a）不同冷冻速率下冰模板法制备 ACol 的示意图；（b）具有排列通道或随机孔隙的胶原敷料的矢状面和横断面SEM 图像，红色双向箭头指示通道宽度；（c）不同多孔结构敷料的孔隙率；（d）不同多孔结构敷料的通道宽度或孔径大小

（2）ACol的吸液行为

使用蓝墨水对比五种不同多孔结构胶原敷料的吸收行为（图 2A）。蓝墨水高度随通道宽度增加而升高，ACol 中的液位高于随机孔隙敷料（图 2B），通道最宽（约 120µm）的 ACol 吸收速度最快。这些结果表明，排列通道结构顺利获得毛细作用有效提高液体吸收速度。毛细作用中，排列通道内液体吸收高度 h 与时间 t 的关系为 h² =（πrγcosθ）/（2η）t（r 为通道半径，γ 为表面张力，η 为液体密度，θ 为液体与管道的接触角），由于 “γ”“η”“θ” 为液体固有属性及与胶原的接触角，是恒定值，因此同一时间内液位高度与排列通道半径呈正相关。ACol 具有类树结构，其排列通道的曲折度低于随机孔隙胶原敷料，这些排列通道促进毛细作用，有助于提升 ACol 的液体吸收能力（图 2D）。此外，将多种敷料浸入液体，24 小时完全饱和后计算最大吸液量与基面积的比值，结果显示改进后的 ACol 最大吸液量仍低于 0.34g/cm²（重度烧伤 24 小时的渗出液量），表明单独 ACol 不足以满足临床需求（图 2C），需进一步改进以提高其最大吸液能力。

图2 不同多孔结构敷料的吸液行为表征。（a）陆续在光学图像显示不同多孔结构敷料的吸液行为；（b）吸收的蓝墨水高度随时间变化，实线为拟合曲线；（c）不同敷料的最终吸收容量；（d）排列通道敷料与随机孔隙敷料的示意图对比

（3）具有定向通道的低温胶原（Cryo - ACol）的表征

树木高效吸水得益于树干中具有排列通道的分级多孔结构以及细胞腔中的互连孔隙，而顺利获得冷冻交联制备的低温凝胶在微米范围内具有孔隙互连性。因此，ACol 经冷冻交联改性得到同时具备排列通道和互连孔隙的 Cryo-ACol（图 3A）。通道宽度为 120μm的 ACol 液体引流速度最快，被选用于后续研究。纵向截面的代表性 SEM 图像显示，Cryo-ACol 的通道壁上存在互连孔隙（图 3B）。Cryo-ACol 的液体吸收效率显著提高（图 3C、D），其吸收容量（0.53±0.01g/cm²）几乎是 ACol（0.26±0.01g/cm²）的两倍，足以满足重度烧伤患者的渗出液吸收需求（图 3E）。

图3 Cryo-ACol 的表征。（a）受树木分级结构启发，将单向冰模板法与冷冻交联结合制备具有排列通道和互连孔隙的胶原敷料（Cryo-ACol）的示意图；（b）Cryo-ACol 和 ACol 的矢状面 SEM 图像；（c）陆续在光学图像显示 Cryo-ACol 和 ACol 的吸液行为，以蓝墨水为示例；（d）吸收的蓝墨水高度随时间变化；（e）Cryo-ACol 和 ACol 的最终吸收容量

（4）用DNA对功能化冷冻脱细胞羊膜胶原蛋白（DNA - Cryo - ACol）进行表征

除渗液管理外，烧伤创面再生还需要免疫细胞的及时动员。为使胶原敷料具备免疫调节特性，利用EDC和NHS对Cryo-ACol进行DNA功能化修饰，最终形成DNA-Cryo-ACol（图4A）。扫描电子显微镜图像显示胶原敷料表面存在DNA功能化修饰（图4B右侧图像），且该修饰未改变排列通道和互连孔隙的结构（图4B左侧图像）。磷是DNA的特征元素，顺利获得能量色散X射线分析（EDAX）和X射线光电子能谱（XPS）检测DNA-Cryo-ACol中磷的相对含量（图4C、D），发现随着DNA溶液浓度从0.25 mg/mL增至2 mg/mL，磷含量也随之增加。免疫荧光图像显示胶原（COL-1抗体，红色）与DNA（核酸染料，绿色）共标记（图4E），初步表明DNA结合于胶原表面。衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）检测显示，在1143–1213 cm⁻¹和950–1068 cm⁻¹处出现强峰，分别代表P-O-P键和P-N-C键（图4F）。顺利获得绿色荧光强度（图4E）和甲基绿吸附实验测定DNA含量，结果显示DNA含量随DNA溶液浓度升高而增加（图4G）。与Cryo-ACol相比，DNA功能化修饰未改变吸液行为（图4H），DNA-Cryo-ACol的引流速度约为64.52 µL/s，吸收容量约为0.53 g/cm²。

图4 DNA-Cryo-ACol 的表征。（a）DNA-Cryo-ACol 的合成示意图；（b）DNA-Cryo-ACol 和 Cryo-ACol 的矢状面 SEM 图像；（c）不同 DNA 溶液浓度制备的 DNA-Cryo-ACol 的 EDAX 元素分析；（d）不同 DNA 溶液浓度制备的 DNA-Cryo-ACol 的 XPS survey 光谱，（e）DNA-Cryo-ACol 的共聚焦激光扫描显微镜图像；（f）不同 DNA 溶液浓度制备的 DNA-Cryo-ACol 的 ATR-FTIR 光谱；（g）（i）E 中 DNA 荧光强度的定量分析，（ii）顺利获得甲基绿吸附实验测定的 DNA-Cryo-ACol 的 DNA 含量；（h）DNA-Cryo-ACol 的吸收速度和容量）

（5）DNA-低温脱细胞胶原中渗出液的管理

利用离体模型进一步评估胶原敷料的吸液特性，将不同多孔结构的胶原敷料置于涂抹了蓝墨水的猪皮上（图5A）。从顶部观察，随机孔隙敷料从中心向边缘吸收墨水（图5B(i)粉色三角形），而排列通道敷料则从边缘向中心吸收墨水（图5B(ii-iv)绿色三角形）。不同敷料的吸收能力存在差异，与Cryo-ACol或DNA-Cryo-ACol相比，商用敷料和ACol处理的猪皮上残留液体更多，猪皮表面的颜色深度反映了这一结果（图5B最右列）；且商用敷料组相比其他组出现明显浸渍（图5B(i)黄色箭头）。

由于顶部视图无法观察敷料内部液体流动，且蓝墨水不能完全模拟重度烧伤渗出液的黏度和密度，故采用有限元模拟重度烧伤渗出液（黏度1.9 mPa·s，密度1.03 g/cm³）以评估敷料的渗液管理效果（图5C、D）。纵向截面模型中，商用敷料内的渗出液流速在初始时呈各向同性，随时间推移，中心流速快于边缘（图5C）；而DNA-Cryo-ACol中边缘流速快于中心，且该现象随时间更明显（图5D），模拟结果与离体模型一致，表明排列通道敷料抑制渗出液浸渍的能力源于渗出液流速在径向的不均匀分布。利用在体模型进一步检验DNA-Cryo-ACol对渗出液的吸收效果（图5A），结果显示商用胶原敷料导致荧光标记渗出液残留和浸渍（图5E白色三角形和白色虚线），ACol也存在渗出液残留（图5E白色三角形），而Cryo-ACol和DNA-Cryo-ACol无此现象。

图5 DNA-Cryo-ACol的渗液管理特性。（a）实验方法示意图；（b）陆续在光学图像观察不同敷料在猪皮上吸收一滴蓝墨水的吸收特性；（c）和（d）有限元模拟显示液体在商用胶原敷料和DNA-Cryo-ACol敷料模型中的吸收情况；（e）敷料处理前后在紫外光下拍摄的创面图像

（6）DNA低温脱细胞胶原的免疫调节特性

为探究DNA-Cryo-ACol的免疫调节潜力，用其处理烧伤创面，于第7天采集创面样本进行 bulk RNA测序，以Cryo-ACol处理的创面组织为对照。差异基因分析显示，Cryo-ACol与DNA-Cryo-ACol处理组的转录组谱存在显著差异（图6A）；京都基因与基因组百科全书富集分析表明，差异基因主要集中在免疫系统（图6B）；基因本体论分析显示，DNA-Cryo-ACol诱导与T细胞免疫应答相关的基因上调，尤其是CD4+T细胞介导的免疫应答（图6C、D(i)）。

与CD4+T细胞发育、分化和功能相关的差异基因如图6D(ii)所示，RNA测序结果提示DNA-Cryo-ACol组中CD4+T细胞数量增加。免疫荧光染色显示，Cryo-ACol募集的CD4+T细胞较少，而DNA-Cryo-ACol处理组中CD4+T细胞大量聚集（图6E、F）。

RNA序列的基因集富集分析显示，胞质DNA感应通路上调，其中Toll样受体9（TLR9）级联反应上调最显著（图6G）。TLR9作为DNA传感器可识别DNA中的未甲基化CpG基序，其免疫应答与释放的CpG基序浓度密切相关。因DNA的免疫调节作用仅依赖CpG基序，选择含多个高密度CpG区域的全长小牛胸腺双链DNA以最大化免疫调节效果。TLR9与DNA的识别顺利获得髓系分化初级反应蛋白88（MyD88）激活下游信号，将CD4+T细胞与真皮外植体共培养检测发现，DNA-Cryo-ACol组中TLR9和MyD88的表达上调（图6H），提示其顺利获得TLR9/MyD88信号通路调节CD4+T细胞行为（图6I）。

为评估DNA-Cryo-ACol在减少瘢痕形成中的潜在免疫调节功效，检测CD4+T细胞中与皮肤瘢痕相关的细胞因子表达，酶联免疫吸附试验显示其促进多种瘢痕相关抑制因子的表达，包括白细胞介素-10（IL-10）和干扰素-γ（IFN-γ）（图6J），其中IL-10分泌增加最显著。

将活化的成纤维细胞与不同敷料或经DNA-Cryo-ACol/胶原敷料趋化的迁移CD4+T细胞共培养，结果显示CD4+T细胞顺利获得抑制活化成纤维细胞中α-SMA的表达，赋予DNA-Cryo-ACol抗瘢痕效果（图6K）。综上，DNA-Cryo-ACol的免疫调节特性是其在体外发挥瘢痕抑制作用的必要条件。

图6 DNA-Cryo-ACol的免疫调节特性及其免疫调节能力对体外瘢痕形成的影响。（a）对照组与DNA-Cryo-ACol组的差异基因热图；（b）差异表达基因的京都基因与基因组百科全书功能分类；（c）基因本体论分析显示DNA-Cryo-ACol对T细胞免疫应答的正向调节；（d）DNA-Cryo-ACol的CD4+T细胞介导免疫应答的基因本体论分析和热图；（e）小鼠烧伤创面对照组或DNA-Cryo-ACol组中DAPI、CD4的共聚焦免疫荧光成像代表性示例；（f）不同组中CD4/DAPI荧光强度的定量分析；（g）基因集富集分析显示DNA-Cryo-ACol的胞质DNA感应通路和TLR9通路上调；（h）TLR9和MyD88表达的蛋白质印迹分析；（i）DNA-Cryo-ACol调节CD4+T细胞机制的示意图；（j）细胞因子酶联免疫吸附试验结果；（k）检测成纤维细胞活化抑制的α-SMA示意图和共聚焦免疫荧光图像

（7）DNA低温海藻酸钙（DNA‑Cryo‑ACol）对体内烧伤创面愈合的影响

在大鼠背部制备深二度烧伤创面，以商用胶原敷料为对照，检测DNA-Cryo-ACol敷料的体内效果，于0、3、7、14、21天对每个烧伤创面进行拍照（图7A）。结果显示，DNA-Cryo-ACol处理的创面闭合率高于商用胶原敷料处理的创面（图7B粉色虚线、图7D(i)）。H&E和Masson三色染色表明，至21天，DNA-Cryo-ACol可促进毛囊再生（图7C黄色星号、图7D(ii)）并形成“篮状”胶原网络（图7C红色箭头）；而商用胶原敷料处理的组织在21天出现明显的平行排列细胞外基质纤维（图7C黑色箭头），且毛囊再生较少。天狼星红染色显示，21天时DNA-Cryo-ACol处理的愈合烧伤创面中Ⅰ型胶原（黄色）和Ⅲ型胶原（绿色）的比例为2:1，与未受伤皮肤相当（图7D(iii)）。

与Cryo-ACol和DNA修饰的商用胶原相比，DNA-Cryo-ACol处理的样本毛囊再生更好，胶原成分比例恢复更佳（图7B绿色虚线、图7C、图7D），实现了烧伤创面的无瘢痕愈合，其排列通道的结构特征和DNA功能化带来的免疫调节作用被认为有助于此过程。

此外，具有排列通道的敷料（DNA-Cryo-ACol和Cryo-ACol）减少了湿性皮炎的面积（图7B蓝色箭头、图7D(i)第3天创面面积），这一结果体现了DNA-Cryo-ACol的体内渗液管理特性。

图7 DNA-Cryo-ACol敷料促进烧伤创面皮肤再生的表征。（a）测试不同敷料治疗效果的动物实验示意图；（b）3、5、7、14天的残留创面面积和21天的瘢痕面积及创面闭合轨迹图；（c）21天愈合烧伤创面的代表性H&E图像、Masson图像和天狼星红染色图像；（d）（i）创面闭合和湿性皮炎分析，（ii）毛囊的组织学定量，（iii）21天胶原Ⅰ/Ⅲ比值的定量

（8）CD4 + T细胞对DNA -冷冻 - ACol诱导的无瘢痕皮肤愈合的影响

体外数据表明DNA-Cryo-ACol敷料可顺利获得调节CD4+T细胞行为抑制促纤维化肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达。为在体内验证该假设，用DNA-Cryo-ACol或Cryo-ACol胶原敷料（对照）处理大鼠烧伤创面，于处理后7天和21天采集样本。结果显示，DNA-Cryo-ACol处理的样本中存在明显的CD4+IL-10+T细胞区域（图8A、B）；且该组在7天和21天时α-SMA的表达显著降低，与正常未受伤皮肤的表达水平相近（图8C、D）。这些初步体内结果证实，DNA-Cryo-ACol敷料应用于烧伤创面可调节CD4+T细胞的富集及免疫细胞中细胞因子的分泌，同时降低瘢痕相关标志物α-SMA的表达。

为探究CD4+T细胞在DNA-Cryo-ACol诱导的无瘢痕皮肤愈合中的作用，在注射抗CD4抗体的CD4+T细胞耗竭C57BL/6J小鼠和注射同型对照抗体的C57BL/6J小鼠中重复伤口愈合实验，并在DNA-Cryo-ACol处理后28天检查伤口愈合效果。结果显示，DNA-Cryo-ACol处理的C57BL/6J小鼠伤口闭合速度更快，且有大量毛发生长（图8F、G），因伤口上长出的毛发，这些伤口难以顺利获得视觉识别；而CD4+T细胞耗竭的C57BL/6J小鼠经DNA-Cryo-ACol处理的伤口出现无毛发的不规则瘢痕（图8F白色虚线范围），且伤口闭合速度较慢（图8G）。CD4+T细胞耗竭组经DNA-Cryo-ACol处理后的瘢痕面积显著增加，达到原始伤口面积的12.67%。DNA-Cryo-ACol处理后28天，H&E和Masson三色染色显示，在未耗竭CD4+T细胞的小鼠中，DNA-Cryo-ACol可显著促进毛囊再生（图8I绿色箭头）并形成篮状胶原网络（图8I红色箭头）；相反，CD4+T细胞耗竭后，愈合的皮肤出现无毛发瘢痕，且胶原束呈水平排列（图8I黑色箭头）。这些研究证实，DNA-Cryo-ACol敷料促进皮肤再生需要CD4+T细胞的免疫应答。

图8 DNA-Cryo-ACol顺利获得募集CD4+T细胞和免疫应答促进皮肤再生的表征。（a）经Cryo-ACol和DNA-Cryo-ACol处理的大鼠烧伤创面中CD4（红色）、IL-10（绿色）和DAPI（蓝色）的代表性共聚焦免疫荧光图像；（b）不同组中CD4和IL-10的荧光强度定量分析；（c）经Cryo-ACol和DNA-Cryo-ACol处理的大鼠烧伤创面中α-SMA的代表性共聚焦免疫荧光图像；（d）不同时间点不同组中α-SMA的荧光强度定量分析；（e）评估在注射同型对照抗体和抗CD4抗体的小鼠中DNA-Cryo-ACol介导的烧伤创面愈合的手术流程；（f）0、7、14、28天的残留创面面积；（g）7和14天残留创面的相应分析；（h）28天瘢痕面积分析；（i）代表性H&E图像和Masson图像；（j）毛囊的组织学定量